СИНТЕРОИДЗ: Cинтетическая биология для промышленного производства стероидов

ООО «Фарминс» является партнером Международного консорциума по Проекту Синтероидз, поддержанного по Программе EC ERA-CoBioTech в рамках программы ERA-NET (Horizon 2020) (www.cobiotech.eu/call-information).
Цель проекта: разработка инновационных интегрированных процессов для биоконверсии фитостеринов в ценные С19 и С22-стероиды на основе синтетической биологии непатогенных актинобактерий. Эти соединения являются ключевыми интермедиатами в синтезе терапевтических стероидов для медицины.
Финансирование российского участника (ООО «Фарминс») в соответствии с условиями сотрудничества в области научных исследований по Программе ЕС осуществляется Минобрнауки РФ (идентификатор проекта RFMEFI58818X0008, дата подписания соглашения - 28 ноября 2018 г.).
Основными направлениями исследований являются:
• Получение и анализ омикс-данных (геномика, транскриптомика, метаболомика, протеомика) стероидпродуцирующих актинобактерий и определение специфических мишеней для создания эффективных микробных продуцентов;
• Создание с применением генетической инженерии бактериальных штаммов – продуцентов ценных С22-предшественников;
• Решение проблем ингибирования целевых биопроцессов конечными продуктами с применением генной инженерии и оптимизации биопроцессов;
• Интеграция процессов биокатализа и выделения (up- и downstream) для обеспечения экологичных биоконверсий.
Исследования ООО Фарминс в рамках международного проекта нацелены на получение генно-инженерных штаммов актинобактерий для производства ряда высоковостребованных стероидных соединений: С22-стероидов; 7-гидроксилированных андростанов; 1,2-дегидроаналогов стероидов.
Цель проекта подразумевает изучение функциональных свойств полученных штаммов, разработку на их основе лабораторных прототипов инновационных биопроцессов, а также оценку, адаптацию и демонстрацию технологических решений на промышленном оборудовании иностранными партнерами проекта (Испания, компания Бионайс (BIONICE)), разработку современной методологии выделения и очистки продуктов (Германия, Технический университет Дортмунда (TUDo)) с использованием строгих подходов к стандартизации, масштабированию и контролю производства, согласно высоким европейским производственным стандартам Надлежащей Лабораторной Практики (Good Laboratory Practice, GLP) и Надлежащей Практики Производства (Good Manufacturing Practice, GMP). Создание и применение инновационных промышленных биопроцессов увеличит конкурентоспособность европейских (в т.ч. российских) производителей и гарантирует высокие стандарты качества.

Этап 1 работ по Проекту (с «26» июня 2018 г. по «31» декабря 2018 г.) завершен.

На Этапе 1 ООО «Фарминс» были получены следующие результаты:
• Составлен аналитический обзор, отражающий современный уровень научно-технических знаний, исследований и разработок по теме проекта на основании анализа 100 литературных источников, 65 из которых были опубликованы в течение последних 10 лет. Современный уровень знаний по теме исследований, достигнутый за последние 2-3 года, в том числе с участием научного коллектива исполнителей проекта позволяет положительно оценивать перспективы проекта и выбранную концепцию исследований.
• Проведены патентные исследования по теме проекта: проанализировано более 250 патентных и литературных источников информации. Были использованы возможности поиска по 63-м ключевым терминам, и отобрано для анализа 38 документов. Патентные исследования подтвердили перспективность темы, ее патентную новизну по ряду направлений и методов
• Получены репрезентативные образцы биологического материала, включающие:
– образцы контрольных и индуцированных двумя стероидными соединениями (β-ситостерином или кортизон-21-ацетатом) культур N. simplex ВКМ Ac-2033Д, пригодные для выделения матричных РНК и полнотранскриптомного профилирования;
– очищенный препарат геномной ДНК Mycobacterium sp. B-8054 пригодный для высокопроизводительного секвенирования..
• Предложены и адаптированы методы хроматографического разделения целевых стероидных метаболитов и побочных продуктов, разработана методика качественного и количественного хроматографического анализа стероидных метаболитов в культуральных жидкостях актинобактерий, включающая 5 инструментальных хроматографических методов. Методика позволяет уверенно разделять и детектировать смеси 22-х стандартных стероидных соединений и веществ-свидетелей в различных комбинациях, образование которых возможно при дальнейшей работе в рамках проекта и будет использована при изучении свойств родительских и генно-инженерных микроорганизмов и разработке целевых биопроцессов.
• Представители ООО «Фарминс» участвовали в организации и работе консорциума участников Европейского проекта Синтероидз, разработке идей и подходов проекта, программы совместных исследований и обмене научной информацией и материалами. Был осуществлён обмен научной и организационной информацией, в рамках деловых контактов и дискуссий с партнёрами Европейского проекта Синтероидз с использованием электронных средств коммуникации, в том числе 2-х телеконференций. Идеи и концепции проекта были представлены специалистам и общественности на международном конгрессе АХЕМА в виде устного доклада «Синтероидз: синтетическая биология для промышленного производства стероидов».
• Задачи отчетного этапа 1 были выполнены в полном объёме. Сведения о ходе выполнения работ по проекту размещены также на ленте Европейского проекта Syntheroids в Твиттер twitter.com/syntheroids. Поученные результаты были опубликованы в виде одной научной статьи и тезисов докладов на научных конференциях:
Glyakina, A.V., Strizhov, N.I., Karpov, M.V., Dovidchenko, N.V., Matkarimov, B.T., Isaeva, L.V., Efimova, V.S., Rubtsov M.A., Novikova L.A., Donova, M.V., Galzitskaya O.V. Ile351, Leu355 and Ile461 residues are essential for catalytic activity of bovine cytochrome P450scc (CYP11A1). Steroids, 2019, 143, 80 – 90 doi.org/10.1016/j.steroids.2019.01.002.
Sola-Landa A.; Barreiro C.; Rodríguez-García A.; Dovbnya D.; Strizhov N.; Ivashina T.; Donova M.; Sletta H.; Josefsen K.; Nordborg A.; Le S.; Merz J.; Schembecker G.; Martínez-Cámara S.; Rubio S.; Rodríguez-Sáiz M.; Barredo J. Syntheroids: Synthetic Biology for Industrial Production of Steroids. Biotechnology for a sustainable bioeconomy III, ACHEMA Daily, 4, June14, 2018, p.17. files.vogel.de/vogelonline/vogelonline/issues/lp/8508.pdf
Фокина В.В., Брагин Е.Ю., Шутов А.А., Донова М.В. Определение генов с высокой дифференциальной экспрессией при индукции ацетатом кортизона у штамма Nocardioides simplex ВКМ Ас-2033Д // V Пущинская конференция «Биохимия, физиология и биосферная роль микроорганизмов», Пущино. 2018. C. 29-30.

Иностранными партнерами проекта в 2018 г. получены следующие результаты:
• Разработаны питательные среды со строго определенным химическим составом.
• Получены репрезентативные пробы Mycobacterium sp. для последующих комплексных исследований.
• Разработаны методы целевого скрининга библиотек мутантных клонов на основе высокопроизводительной масс-спектрометрии (Rapidfire-MS) стероидных соединений.
• Выполнены задачи по координированию европейского проекта Синтероидз, организованы отчетные и демонстрационные мероприятия; осуществлен обмен научной информацией с партнерами; проект представлен на демонстрационных мероприятиях научному сообществу и общественности.

Этап 2 работ по Проекту (Соглашение с Минобрнауки РФ от «28» ноября 2018 года № 075-11-2018-096 (14.588.21.0008), уникальный идентификатор Проекта RFMEFI58818X0008), с «01» января 2018 г. по «31» декабря 2019 г. завершен.

На Этапе 2 ООО «Фарминс» были получены следующие результаты:

  • Осуществлено высокопроизводительное секвенирование тотальной мРНК культур Nocardioides simplex ВКМ Ас-2033D, выращенных в различных условиях индукции стероидными соединениями. Проведены анализ и аннотирование дифференциально экспрессирующихся генов, а также сравнительный анализ полногеномного ответа на индукцию фитостерином у simplex ВКМ Ac-2033D в сравнении с сапротрофным штаммом Mycobacterium sp. ВКМ Ac-1817D. Подтверждено наличие двух новых кластеров генов стероидного катаболизма C и D у N. simplex ВКМ Ac-2033D. Установлены особенности регуляции активности биоконверсии ацетата кортизона у N. simplex ВКМ Ac-2033D на уровне транскрипции. Идентифицированы гены, обусловливающие высокую целевую активность и нежелательную активность в отношении стероидных субстратов.
  • Исследован профиль стероидных метаболитов, образуемых актинобактериями Mycobacterium B-8054 из фитостерина в различном физико-химическом окружении и Nocardioides simplex ВКМ Ac-2033Д – из фитостерина, и 1-насыщенных стероидных субстратов. Идентифицированы новые С19- и С22-стероидные продукты, в том числе, соответствующие С22-карбоксикислоты, метиловые эфиры и C22-стероидные спирты с различными комбинациями 1(2)- и 17(20)-двойных связей. Установлена зависимость селективности окисления фитостерина штаммом Mycobacterium sp. B-8054 от условий биоконверсии и выявлены условия, способствующие преимущественному накоплению C22-метиловых эфиров стероидных карбоксикислот, или неэтерифицированных C22-стероидов.
  • Созданы рекомбинантные плазмиды pUC-∆fabG3-Km, pEX-∆fabG3 и pEX-∆fabG3-Km, которые содержат немаркированные и маркированные делеции в ряде целевых генов стероидного катаболизма и предназначены для введения направленных мутаций в геном штамма Nocardioides simplex ВКМ Ас-2033Д. Разработана методология генетической трансформации simplex ВКМ Ас-2033Д на основе использования реплицируемой плазмиды. Предложена дополнительная стратегия конструирования продуцента стероидных дегидроаналогов, на основе гетерологической экспрессии уникальной СДГ из N. simplex ВКМ Ас-2033Д в подходящем организме-хозяине; на основании анализа геномных последовательностей и особенностей метаболизма предложены кандидатные реципиентные штаммы.
  • Созданы рекомбинантные плазмиды для получения продуцентов С22-стероидов путём направленного введения мутаций в геномы штаммов neoaurum, содержащие фрагменты геномной ДНК M. neoaurum для гомологичной рекомбинации и мутантные аллели генов ацетил-КоА ацетилтрансферазы, β-гидроксиацил-КоА дегидрогеназы, кетоацил КоА тиолаз. Cконструированы рекомбинантные плазмиды, содержащие аллели дикого типа генов и предназначенные для комплементации мутаций, подтверждения функций генов, и получения штаммов с повышенным числом копий генов. Проведен направленный мутагенез и получены штаммы M. neoaurum с мутациями в гене ацетил-КоА ацетилтрансферазы. С учётом полученных результатов и выявления потенциальных рисков, предложена дополнительная стратегия введения направленной мутации в геном M. neoaurum для инактивации одного из целевых генов.
  • Сконструированы три набора рекомбинантных плазмидных конструкций, предназначенные для получения штаммов-продуцентов 7-гидроксилированных андростанов путём гетерологической экспрессии цитохромов P450, и содержащие моноцистронные и трицистронные экспрессионные кассеты целевых генов, совместно с кДНК-копиями генов переносчиков электронов, а также моноцистронные кассеты химерных генов, слитых из генов цитохромов P450, и фрагмента гетерологичного гена, кодирующего редуктазный домен.
  • Разработана методология гетерологической экспрессии систем 7-гидроксилирования стероидов в микобактериях. Произведен комбинированный поиск энзиматических систем 7-гидроксилирования стероидов, основанный на практическом скрининге грибных стероидтрансформирующих штаммов и последующем биоинформатическом анализе. Идентифицированы новые гены семейства цитохромов Р450, продукты которых, с высокой вероятностью, катализируют целевую активность 7-гидроксилирования андростанов.
  • Проведены дополнительные патентные исследования, которые подтвердили возможность патентной защиты пяти технических решений, разработанных в ходе проекта и позволяют внедрять разработку без приобретения дополнительных лицензий.
  • На постоянной основе осуществлялся обмен научно-технической информацией с партнерами – членами международного консорциума Европейского проекта Синтероидз, участие в отчётных и демонстрационных мероприятиях, в том числе во 2-й Общей встрече (Генеральной ассамблее) участников международного консорциума по проекту Синтероидз (24 января 2019 г., Дортмунд, Германия). Организована и проведена 3-я Общая встреча (1 октября 2019 г., Пущино, Россия). Проведены обсуждения с использованием электронных средств коммуникации. Идеи и результаты проекта были представлены научной общественности на 2-х научных симпозиумах: «VII съезд Вавиловского общества генетиков и селекционеров», а также на 2-м Российском микробиологическом конгрессе.

Иностранными партнерами проекта в 2019 г. получены следующие результаты:

  • Определена последовательность генома Mycobacterium NRRL B-8054 и выявлены отличия генома от референсного штамма Mycobacterium neoaurum NRRL B-3805.
  • Разработаны новые аналитические инструменты для детекции, количественной оценки и тонкого анализа интермедиатов и целевых стероидных продуктов биоконверсии стероидов, в частности, на основе i) LC-UV-QTOF; ii) LC-QQQ iii) RapidFire QQQ. С применением этих методов подтверждены структуры основных образующихся стероидов и выявлены ряд новых соединений.
  • Оценены экспрессионные профили генов и ферментов в присутствии АД или АДД, выявлены основные кандидатные гены, вовлеченные в ингибирование окислительной деградации стеринов С19-стероидами. Сконструированы делеционные мутанты и суперпродуценты neoaurum по выявленному транскрипционному регулятору.
  • На основе применения химического мутагенеза создана библиотека мутантов и инструментарий для скрининга микобактериальных клонов Mycobacterium neoaurum B-3805 включающий метод сортинга целых клеток (Fluorescence-activated cell sorting, FACS), культивирование в миниатюризированных биореакторах, быстрый анализ продуктов. Сконструированы суицидные векторы и мутантные штаммы neoaurum B-3805 с делециями по генам двум ключевым генам катаболизма на уровне С22-стероидов.
  • Разработана модель процесса выделения целевого продукта биотрансформации с использованием концептуального дизайна роботизированной методологии.
  • Оптимизированы условия лабораторных ферментаций в 5 л биореакторах.

Заключение:

  • Задачи отчетного Этапа 2 были выполнены в полном объёме.
  • Сведения о ходе выполнения работ по проекту размещены также на ленте Европейского проекта Syntheroids в Твиттер https://twitter.com/syntheroids. Полученные результаты были опубликованы в виде трёх научных статей и тезисов докладов на научных конференциях:
  1. Kollerov, V., Shutov, A., Kazantsev, A., Donova, M. Biotransformation of androstenedione and androstadienedione by selected Ascomycota and Zygomycota fungal strains. Phytochemistry. 2020, 169, 112160. https://doi.org/10.1016/j.phytochem.2019.112160
  2. Bragin, E.Y., Shtratnikova, V.Y., Schelkunov, M.I., Dovbnya D.V., Donova M.V. Genome-wide response on phytosterol in 9-hydroxyandrostenedione-producing strain of Mycobacterium VKM Ac-1817D. BMC Biotechnol. 2019, 19:39, 1-16. https://doi.org/10.1186/s12896-019-0533-7
  3. Poshekhontseva, V.Y., Bragin, E.Y., Fokina, V.V., Shtratnikova, V.Y., Starodumova, I.P., Tarlachkov, S.V., Donova, M.V. Draft genome sequence of FK506-producing Streptomyces tsukubensis strain VKM Ac-2618D. Microbiol. Resour. Announc. 2019, 8, e00510-19. https://doi.org/10.1128/MRA.00510-19
  4. Фокина, В.В., Донова, М.В., Штратникова, В.Ю., Брагин, Е.Ю. Дифференциальная экспрессия генов катаболизма стероидов у Nocardioides simplex ВКМ Ас-2033Д при индукции фитостерином // «VII съезд Вавиловского общества генетиков и селекционеров, посвященный 100-летию кафедры генетики СПбГУ, и ассоциированные симпозиумы», Сборник тезисов (Санкт-Петербург, 18-22 июня 2019). C. 1095.
  5. Коллеров, В.В., Шутов, А.А., Донова, М.В. Структурная модификация 3-оксостероидов мицелиальными грибами. // «2-й Российский микробиологический конгресс» 23-27 сентября 2019 г. Материалы конгресса. Издательство Мордовского университета. Саранск, 2019. С. 68.